近年来随着分子生物学和基因工程等生物医学技术的飞速发展，多种由于基因缺陷而导致的疾病，如镰状细胞贫血、帕金森病、某些自身免疫缺陷性疾病以及肿瘤等逐渐被认识，使人们不仅对该疾病的发病机制有了更深入的了解，也使得基因治疗得以不断地发展。经过数十年的研究和发展，基因治疗目前已从单纯的实验室研究转向多种人类疾病的治疗，并取得了令人瞩目的成就。前期的临床试验已证实基因治疗用于人类疾病的可行性和安全性，但目前为止临床Ⅱ/Ⅲ期试验的效果还不尽如人意。主要问题之一就是如何在活体条件下无创地进行目标组织或器官中治疗基因的表达及治疗疗效的监测，这也是目前分子影像学研究的热点之一。
报告基因显像是近年来迅速发展的一种无创、灵敏的可在活体条件下实时监测治疗基因表达的方法，特别是放射性核素报告基因显像(SPECT/CT和PET/CT等) 具有空间分辨率好、灵敏度高和特异性强的优点，近年来得到了快速的发展，并展示了良好的应用前景[1-5]。本文仅就放射性核素报告基因显像用于监测基因治疗的原理、特点及应用进行综述。
Part.1
核素报告基因的概念及特征
报告基因是一种可编码易被检测的蛋白质的基因，其与目的基因融合后表达的产物可用来显示目的基因的表达。报告基因系统的基本组成主要包括启动子和报告基因两个密不可分的部分，其中报告基因编码易检测的蛋白质，而启动子则调控报告基因表达。通过将报告基因与治疗基因重组的报告基因系统导入靶细胞内，在调控序列的控制下两者进行同步表达，其中报告基因的表达产物可通过放射性核素标记的探针进行检测，从而直观地“报告”目的基因的表达情况。所以，通过报告基因的成像可以间接实现对治疗基因表达的监测[6]。
作为放射性核素报告基因，应具备以下特征：报告基因产物无抗原性;报告基因应不存在于宿主中或易于与内源性基因相区别;报告探针可以被报告基因表达产物特异性地摄取;报告基因能长期、稳定、安全地表达，且表达水平与治疗基因一致;载体、报告基因产物和探针不影响治疗基因的表达和靶细胞的正常生理功能;报告探针应能迅速从血液中清除等。但目前已知的报告基因系统均难于满足上述所有条件，有待今后开发更为有效的报告基因系统，满足不同基因治疗监测的需要[7]。
Part.2
核素报告基因的分类
目前常用的报告基因有多种，可按编码产物不同分类。以酶为基础的报告基因包括单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(herpes simplex virus-Ⅰthyminekinase，HSV1-tk) 报告基因及人线粒体胸苷激酶2( human thymidine kinase-2，hTK2) 报告基因等;以转运体为 基础的报告基因包括人钠碘同向转运体(human sodium-iodide symporter，hNIS) 报告基因、人去甲肾上腺素转运体 (human norepinephrine transporter，hNET)报告基因等;以受体为基础的报告基因包括人 多巴胺D2受体( human dopamine D2receptor，hD2R) 报告基因和人生长抑素2型受体(human somatostatinreceptor-2，hSSTR2) 报告基因等[8,9](表 1) 。
Part.3
核素报告基因的应用
放射性核素报告基因目前在基因治疗中得到了广泛应用，并取得了良好的效果;但每种报告基因均有其优势和不足。
3.1 酶报告基因
3.1.1 HSV1-tk 基因
HSV1-tk 基因是目前使用最普遍、研究最成熟的放射性核素报告基因显像系统。HSV1-tk 能编码催化磷酸化的酶，使放射性核素标记的该酶底物包括各种嘌呤及嘧啶底物或其类似物磷酸化，磷酸化后的底物不能穿出细胞膜外而聚集于细胞内，从而通过核医学仪器进行显像。其底物也是核苷类的前体药物(如阿昔洛韦、无环鸟苷、更昔洛韦等) ，因此 HSV1-tk 基因同时也是非常重要的治疗基因，可用于肿瘤等的基因治疗[10]。Jacobs 等[11]在一项复发性胶质母细胞瘤的临床Ⅰ～Ⅱ期基因治疗研究中，向瘤内注射脂质体基因复合物 LIPO-HSV1-tk，以更昔洛韦作为前体药物，利用124I-FIAU PET 显像监测基因表达。5 例患者中，1 例基因治疗有效，PET 显示肿瘤内124I-FIAU 特异性摄取;更昔洛韦治疗后，FDG( 氟代脱氧葡萄糖) -PET 和 MET( 甲基-L-蛋氨酸) -PET 显示该区域组织坏死; 其他 4 例治疗无效患者，PET 显示肿瘤内无124I-FIAU 摄取;研究表明，通过 HSV1-tk 报告基因探针的 PET 成像，可用于肿瘤基因治疗的监测。之后，Penuelas 等[12]在一项临床前期试验中，向肝癌患者瘤内注射以腺病毒为载体的 HSV1-tk 基因( AdCMVtk) ，2d后以18F-FHBG 作为报告探针进行 PET-CT 核素显像，结果发现所有瘤内注射超过 1 × 1012病毒颗粒的患者均能监测到瘤内基因表达，且在远处脏器和周围肝硬化组织中均未发现特异性的基因表达，证明了HSV1-tk基因用于肿瘤基因治疗以及18F-FHBG 用于监测治疗基因表达具有可行性。以 HSV1-tk 基因作为报告基因的一大优势是酶基因的表达产物可介导信号的级联放大，敏感性高，利于信号探测; 但因 HSV1-tk 报告基因是一种非人类基因，临床应用中可产生针对该基因转导的细胞或者组织的免疫反应[4，13]，影响其重复使用和长期监测。Kang 和 Likar 等[14，15]分别在研究中发现，HSVl-tk 基因的突变型——HSV1-sr39tk和HSV1-A167Ysr39tk 基因对标记探针 FEAU 具有更高的亲和力和催化效能，且免疫原性较低，预示了较好的应用前景。
3.1.2 hTK2 基因
由于 HSV1-tk 基因作为非人源基因，其产物易引起人体免疫反应，因此一种新的具有与 HSV1-tk 报告基因相似的人源性报告基因——hTK2 基因正日益受到关注。在非复制型细胞中，细胞基质内的脱氧核苷酸合成下调，线粒体 DNA 只能依靠线粒体补救旁路酶来合成，而 hTK2 即是 4 种表达在线粒体内的脱氧核苷酸激酶之一[16]。hTK2 同样具有磷酸化脱氧胞苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷以及多种核苷类似物的功能[17]。由于 hTK2 基因高表达，并能从线粒体到达胞质内进行再定位，且不受线粒体内膜的阻碍，提高了对报告探针磷酸化的生物利用度，并能长期监测目的基因的表达[4]，展示了良好的临床应用前景。研究发现，一种在 N 端截短了 18个氨基酸的 hTK2 ( ΔhTK2) 具有比 hTK2 更好的生物效能。Ponomarev 等[18]通过重组反转录病毒介导ΔhTK2-GFP 基因感染神经胶质瘤细胞的体内外研究显示，ΔhTK2 在被感染细胞的胞质内成功表达，且124I-FIAU 和18F-FEAU 在裸鼠移植瘤内的浓聚水平是对照组的 6 倍以上。另外，此项研究同时探索了ΔhTK2 基因激活多种抗肿瘤前体药物对肿瘤细胞的基因治疗效果，发现阿糖胞苷在 0.04 μmol 水平时即对 ΔhTK2 感染的肿瘤细胞具有 50% 抑制浓度( 即IC50 = 0.04 μmol) ，而对照组则需 0.26 μmol。以上研究结果证明，利用 ΔhTK2 基因进行基因治疗及其监测具有可行性。
3.2 转运体报告基因
3.2.1 hNIS 基因
hNIS 是位于甲状腺滤泡细胞膜上的一种跨膜糖蛋白，可利用 Na+-K+-ATP 酶提供的能量促进碘离子的主动转运，使碘离子顺着电化学梯度从间质进入细胞。除甲状腺组织外，hNIS 也在唾液腺、胃黏膜、脉络膜、分泌期的乳腺等组织器官中低水平表达[19]。hNIS 基因既是报告基因，同时也可作为治疗基因。分化型甲状腺癌细胞高水平表达 hNIS，因此可进行131I 的治疗; 而对于非甲状腺组织肿瘤，可将 hNIS 基因通过病毒等载体转染入肿瘤细胞，使其表达 hNIS，进而可通过131I 进行治疗[20]。Barton 等[21]在临床Ⅰ期试验中，将重组有 2 个自杀基因和 NIS 报告基因的溶瘤腺病毒( Ad5-yCD/mut-TKSR39rep-hNIS) 转染前列腺癌，并 行 SPECT/PET显像。研究结果表明，78% (7/9) 的患者肿瘤内 hNIS基因表达时间可长达 1 周以上，表达高峰在注射后的1～2d，且前列腺外组织器官未见 hNIS 基因表达。因此，首次在人体内证实，hNIS 报告基因可用于基因治疗以及病毒载体的体内生物分布的监测。与其他放射性核素报告基因相比，hNIS 具有诸多优势：hNIS 是内源性基因，其编码产物是一种生理性蛋白，理论上无免疫原性;hNIS 报告基因的表达产物在胞膜上，较 HSV1-tk 等胞内酶类的报告基因更易捕获报告探针;内源性的 hNIS 基因仅在几个特定的组织和器官表达;hNIS 的底物报告探针为常用放射性核素，如123I、99mTc 等核素，无需标记，价格便宜，易于获取;可用于常用核医学显像仪器 SPECT 或 PET 显像;hNIS 作为报告基因，较 SSTR2 和 hD2R 等具有更好的稳定性[4，22]。但 hNIS 报告基因也存在某些不足，如 hNIS 基因为内源性基因，某些器官组织如甲状腺、胃黏膜、乳腺、唾液腺等均有不同程度的表达，影响了 hNIS 基因表达的监测;另外，对于非甲状腺组织细胞，hNIS 基因介导放射性碘摄取后，因缺少甲状腺组织特有基因，不能使碘离子有机化而有效滞留，排出较快，尽管减少了组织的辐射损伤，但同时也影响了信号的探测[20，23，24]。
3.2.2 hNET 基因
hNET 是位于细胞膜上的一种跨膜蛋白，能介导去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺等儿茶酚胺类物质跨膜转运。hNET 主要分布于中枢及外周交感神经系统(如脑、心脏等) 。因其仅在体内特定的器官和组织内表达，hNET 被视为具有应用潜力的报告基因[25]。另外，hNET 也是一种生理性的跨膜蛋白，不引起体内免疫反应，具有体内长期安全监测的优势[26]。Moroz 等[26]以反转录病毒为载体，构建了pQCX-hNET-IRES-GFP 重组病毒，以hNET 基因作为报告基因，GFP 基因代替治疗基因进行治疗基因的监测研究。体外研究显示，感染的三种细胞系的 GFP 荧光表达强度与报告探针 MIBG 摄取呈正相关;体内研究显示，124I-MIBG 小动物PET显像较123I-MIBG SPECT显像 更具优势，主要是由于124I的半衰期长，且体内组织的放射性核素清除速度比124I-MIBG 快 5 倍多，在注射124I-MIBG 48h 和72h后，肿瘤/肌肉放射性活度比分别达49∶1 和130∶1，从而在延迟显像中使肿瘤显像更清晰。该研究表明，hNET 作为核素报告基因监测治疗基因的表达具有可行性。在另一项研究中，Buursma 等[27]构建重组腺病毒载体 AdTrack-hNET，以 hNET 基因作为报告基因，EGFP 基因代替治疗基因。注射报告探针11C-mHED 后进行 PET 核素显像和 EGFP 荧光显像，发现11C-mHED 摄取值和 EGFP 荧光强度呈正相关，同样也证明了 hNET 作为报告基因监测共表达的治疗基因的可行性。hNET 作为人源的转运体类报告基因，与 hNIS 基因具有相似的优缺点[4,26 - 29]。
3.3 受体报告基因
3.3.1 hD2R 基因
hD2R 在体内主要分布在纹状体和垂体，是少数能够进行脑内细胞示踪的放射性核素报告基因系统之一[30]。18F-FESP 等报告探针脂溶性高，可以通过血脑屏障与 hD2R 受体结合，具有较高的亲和力。故通过重组 hD2R 基因的病毒载体转染肿瘤细胞后，以18F-FESP 为探针，可在活体条件下通过 PET 显像进行治疗基因表达的监测。Liang等[31]以腺病毒为载体构建了hD2R 基因、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES) 序列和 HSV1-sr39tk 基因的重组病毒，经小鼠尾静脉分别注射 hD2R 的报告探针18F-FESP 及 HSV1-sr39tk 的报告探针18F-FHBG 后，micro-PET 显像可见肝脏内两者的放射性摄取具有相关性。研究显示，通过 hD2R报告基因 PET 成像可在活体条件下无创、定量及重复地进行治疗基因表达的监测。然而，由于 hD2R 受其受体饱和性的影响，敏感性相对较低[32]。另外，hD2R 还可造成 G 蛋白耦联受体介导的细胞内信号通路的激活，导致靶细胞或组织的生理学变化;而突变型的hD2R( D2R80A 和 D2R194A) 则避免了相关生物学效应的产生，同时又具有与18F-FESP 等报告探针相同的亲和力[30，33，34]，因此，具有更好的应用前景。
3.3.2 hSSTR2 基因
hSSTR 在体内主要分布在垂体前叶、软脑膜、胰腺、胃肠道黏膜、肾和肺等组织器官，共有 5 种亚型( 1、2a、2b、3、4 和 5 型)，hSSTR2 与肿瘤的关系最为密切[35]。生长抑素或生长抑素类似物( somatostatin analogue，SSA) 通过与肿瘤( 如各种神经内分泌肿瘤、类癌等) 细胞表面的 hSSTR2 结合，抑制其增 殖，从而达到治疗目的[36，37]。对于某些hSSTR2 表达缺失或低表达的肿瘤，如胰腺癌，可通过转基因的方法，将 hSSTR2 基因导入肿瘤细胞内，使之表达 hSSTR2，便可通过 SSA 进行基因治疗。同时也可通过放射性核素标记的 SSA ( 如111In-奥曲肽、99mTc-P829 等) 进行肿瘤 hSSTR2 表达的显像，进行基因治疗的监测[4，35]。Zinn 等[38]利用双启动子方案，构建了编码 hSSTR2a 基因和 HSV1-tk 基因的重组腺病毒 Ad-pCMV-hSSTR2a-pCMV-HSV1-tk，感染人肺 癌细胞 A427 后发现，细胞摄取99mTc-P2045( hSSTR2a 配体) 和125I-FIAU ( HSV1-tk 配体) 的放射性之间具有相关性，表明 hSSTR2 报告基因系统用于治疗基因表达的监测具有可行性。同样，hSSTR2 基因作为内源性基因，其表达产物不会产生免疫反应;但 hSSTR2 也会激活细胞内信号通路。Han 等[39]构建了突变型的 HA-SSTR2 Δ314 报告基因，消除了hSSTR2 相关生物学效应的影响，其表达产物不会引起细胞内 cGMP 和 cAMP 的变化，对细胞增殖亦无影响，是一种更具前景的报告基因。
Part.4
结语
尽管每种报告基因系统都有其自身的优势和不足，例如 HSV1-tk 报告基因具有信号放大作用，灵敏度高，易于信号检测，但因非人源性基因，其表达产物可引起机体的免疫反应;而 hNIS 虽无免疫源性，但受到受体饱和性的影响，其敏感性较低，且背景信号干扰较多。随着人类基因治疗和分子显像技术的发展，新的或改良的报告基因系统、双报告基因系统甚至是多报告基因系统的研究和运用，有望解决这些问题。尽管大部分基因治疗和报告基因显像监测尚处在试验阶段，但随着基因治疗和分子影像技术的不断发展，放射性核素报告基因显像在基因治疗的监测方面将会取得长足的发展。
