高通量蛋白质组学分析辐照山羊肉的蛋白质组变化

今天为大家带来一篇发表在Food Chemistry上的文章，Unravelingproteome changes of irradiated goat meat and its relationship to off-flavoranalyzed by high-throughput proteomics analysis，文章的一作兼通讯作者是陕西科技大学食品与生物工程学院的魏佳。

辐照是一种延长羊肉保质期的保鲜技术，以Co-60等放射性同位素作为辐射源产生γ射线于目标物质上，达到杀菌效果。然而，辐射可以通过破坏氢键和二硫键来破坏蛋白质的结构，而羊肉中的不饱和脂肪酸和肌红蛋白含量很高，容易受到辐照产生的自由基攻击，从而影响羊肉的食用品质，并产生异味。作为肉的重要属性之一，风味也用于评估肉的质量，消费者通常将异味与不卫生和陈旧联系在一起，从而影响到购买欲。

为了评估辐照对羊肉的影响，这篇文章采用高通量蛋白质组学技术考察了辐照羊肉的蛋白质组的谱图变化情况和产生异味的原因。通过蛋白质组学方法，作者团队总共确定了207种丰度发生显著变化的蛋白质。统计分析结果表明，不同辐照剂量的样品之间存在显着差异。文章还研究了关键蛋白与异味之间的关系，并鉴定出羊肉的辐射异味是由二十六个蛋白质引起，这些蛋白质主要参与半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢以及蛋白质的氧化过程。此外，辐照产生的异味会在羊肉储存期间的代谢过程中逐渐消散，于是作者团队还进行了化学参数分析以佐证蛋白质组学结果，进一步解释了辐照羊肉中蛋白质与异味之间的关系。

在这里我们主要介绍文章中对不同辐照剂量下羊肉蛋白质组的变化的探索方法和分析，文中运用了许多软件分析和统计的方法，可以为蛋白质组学中的数据整理提供一些思路参考。关于蛋白质样品处理，作者团队先按每次辐照剂量取2g磨碎的羊肉与提取缓冲液混合，置于冰上匀浆，经超声处理和离心，收集上清液。之后，依次经过烷基化孵育、离心、过滤膜、胰蛋白酶酶切和除盐步骤，获得蛋白质样品，用于UHPLC-Q-Orbitrap检测。获得的结果使用MaxQuant软件进行分析，蛋白与从UniProtKB网站获得的羊蛋白质数据库匹配，并通过蛋白质非标记定量技术进行定量。

如图1 A所示，显示了五种辐照剂量的羊肉样品的蛋白质分布。在五个辐照过的羊肉样品中一共鉴定出289种共有蛋白。此外，绘制了火山图以筛选出倍数变化较大的蛋白质以进行进一步研究。对于羊肉样品中鉴定出的蛋白质，进行了PCA分析以区分五个照射样品组。随后在实验数据上进行了ANOVA和PLS-DA以鉴定五种辐照剂量下可以用于区分羊肉的重要蛋白质。

图1.在五个辐照剂量(0 kGy，1 kGy，2 kGy，4 kGy和6 kGy)下的羊肉样品的截面图和统计分析。(A)不同辐照羊肉的蛋白质的变化曲线，条上的数字表示共有的蛋白质。(B)不同辐照剂量下羊肉的PCA评分图。(C)在不同辐照剂量下(R2= 0.999和Q2= 0.997)羊肉的PLS-DA得分图。

根据上述算法，PCA的得分图(图1 B)显示，84.7%的可变性是因为两个主成分分别占异变总数的45.4%和39.3%。可以看到，来自不同辐照剂量的羊肉样品组可以被鉴定出的蛋白质完全分离并分布在不同的位置，这表明蛋白质谱分析存在显著性差异。基于LFQ强度数据的方差分析结果表明，在5种被辐照的羊肉中，227种常见检测蛋白质的丰度存在统计学差异(P <0.05)。可以推测，这是由于不同剂量的蛋白质不同程度的放射分解引起的。此外，这些重要蛋白满足文献统计分析的要求，即使用ANOVA比较差异丰度，显著性水平P<0.05。随后用PLS-DA以确定分离的关键蛋白。PLS-DA的得分图所示(图1 C)，五个被辐照样品之间存在明显区别(R2 =0.999和Q2=0.997)。交叉验证后，在已建立的PLS-DA模型中，五个调查的辐照羊肉样品显示100%的差异。在PLS-DA模型中，计算相应的VIP分数以评估所研究蛋白质的性能。最后，通过同时考虑倍数变化>2或<0.5，P<0.05和VIP得分>1，突出显示差异丰富的蛋白质(总共207个)。

接下来进行更严格的测试，对筛选出的蛋白质进行了不同生物学数据集的无监督分层聚类，以评估其合理性和准确性，并比较这些差异表达蛋白质的动态变化。对五个辐照样品组中显著不同的蛋白质进行了聚类分析，最终结果显示在热图中(图2)提供了可视的数据信息。尽管在每个样品组的六个生物学重复样品中显示了相似的颜色布局，但以不同剂量(0、1、2、4和6 kGy)照射的样品表现出不同的颜色分布。对不同辐照样品组的聚类分析显示，M1(1 kGy)和M6(6 kGy)首先聚集为一个簇，然后是M0(0 kGy)，M2(2 kGy)和M4(4 kGy)是最遥远的群体。总体而言，PCA和热图的统计分析结果高度一致，表明辐照处理后差异表达的蛋白质能够区分羊肉样品，可以用公式证明样品分类的结果。蛋白质氧化的结果表明，羊肉的蛋白质在不同剂量下发生了显著变化。据报道，经辐照的火鸡产品中的蛋白质变化是剂量依赖性的，与目前的分析高度吻合。这可能是受不同剂量辐照的羊肉样品之间差异显著的主要原因。